巢式pcr如何设计引物，巢式pcr怎么做巢式pcr怎么做简单呐，主要

SP，MSP引物设计的一个最大问题在于亚硫酸氢盐的转化使得模板的序列复杂性大大降低，而且经常产生T或G或者富含GC片段交替出现的序列。这个会使引物选择变得困难。因此，往往我们需要设计巢式引物来解决这个问题。BSP,MSP引物的设计，除了要遵循引物设计的基本原则外，还要注意一下一些规则：

（1）引物结合位点应该在原始序列中包含4个以上胞嘧啶来确保转化后的DNA的特异性。

（2）BSP引物不应包含CG二核苷酸，长度在25－30bp较为合适；MSP引物因为往往具有较高的GC比，长度应适当缩短。

（3）扩增片段一般认为不要超过650bp，以保证PCR的效率。

（4）对于MSP引物，应该包含3－5个潜在可甲基化位点，且引物的3端应该是一个潜在的可甲基化胞嘧啶，以得到最大化的特异性。

（5）MSP中，U引物与M引物应该具有接近的TM值。

一些网站提供了BSP,MSP引物的免费设计服务，本人也尝试在网上设计过，感觉里面算法过于简单，无法得到满意的引物。在实验中，本人采用了premier5设计的引物。具体做法如下：

（1）获取感兴趣的启动子序列，将序列中非CG二核苷酸的C全部转化为T（word可实现此功能）；

（2）序列载入premier5，按上述原则筛选引物。

（3）MSP引物中的一条往往是由需要确定，因此我们可以直接利用premier5筛选其互补引物。

MSP引物要求的苛刻性常常使得引物的设计变得不可能，在满足规则（4）的情况下，可设计外侧BSP引物，利用BSP产物进行MSP.

BSP,MSP引物设计的另一个困难在于无法进行全基因组的blast，这也让巢式扩增显得更加必要。

巢式建筑是以蜂巢为原型的结构房屋。无论是圆顶房屋或是复杂的蜂巢房屋，建筑师们似乎永远都不会厌倦这些充满自然感的设计。

蒙古包是蒙古族牧民居住的一种房子。建造和搬迁都很方便，适于牧业生产和游牧生活。蒙古包古代称作穹庐、“毡包”或“毡帐”。

如果是扩增启动子的话，建议选择引物的长度30-35bp，一般试剂盒里有接头引物的，只要在下游已知序列设计引物就可以咯

打个比方,比如你要扩增的目的基因在第200bp～400bp,内套的引物分别在200bp处（引物1）和400bp（引物2）处.

外套引物可以设计在100bp处（引物3）和600bp（引物4）处（位置看情况自己选,要在200bp前面和400bp后面）.

或者外套引物也可以设计成100bp处（引物3）,然后和400bp处（引物2）的引物配对作为外套引物（引物3,引物2）