CircPrimer

环状RNA(circular RNAs, circRNAs)是一类由mRNA 前体(pre-mRNA)经反向剪接形成的共价闭合环状非编码RNA。CircRNA最早是在上世纪70年代在病毒中被发现，但是由于早期RNA文库制备广泛使用polyA富集的方式（circRNA没有游离的5’和3’末端），以及RNA-seq读数要求以线性方式与基因组对齐的计算算法，导致大量circRNA的信息被遗漏，使得人们一度认为环状 RNA 只是错误剪接的副产物，对circRNA的关注并不高。

随着高通量测序技术和生物信息学的发展，成千上万种circRNA被发现，围绕着circRNA的基础研究也越来越多。大量研究表明circRNA在哺乳动物细胞中具有内生、丰富、保守、稳定等特点，并经常表现出组织或时空特异性，可以通过多种机制参与机体生长发育调控，以及疾病的发生和发展。因此，近年来circRNA逐渐成为非编码RNA研究领域的热点。

根据circRNA序列的来源，可以分为3类： 1. 序列全部来源于外显子，称为Exonic circRNAs   2.  序列来源于外显子和内含子，称为EIciRNAs   3. 序列全部来源于内含子，称为ciRNAs。

circRNA是由mRNA前体（pre-mRNA）经反向剪接（back-splicing）形成的，目前报道的成环模型主要有以下3种：

· 内含子反向互补序列驱动环化环化

外显子两端的侧翼内含子含有多对反向互补序列，反向互补序列促使内含子序列配对，使得下游的剪接供体（Splice-Donor）与上游的剪接受体（Splice-Acceptor）靠近，从而结合形成环状RNA。（图1.左）

· RNA结合蛋白驱动环化

环化外显子两端的侧翼内含子含有RNA结合蛋白（RBPs）识别的基序，RBP分别与两翼内含子特异基序结合后，会形成二聚体，促进两翼内含子互相靠近，进而连接成环。（图1.右）

· 套索驱动环化

mRNA前体剪接时，会发生外显子跳读事件，产生包含外显子和内含子的套索中间体，随后该中间体发生反向剪接，形成环状RNA。（图2.）

circRNA最常见的功能是作为miRNA海绵体与miRNA结合，从而影响miRNA对基因的调控。比如研究得比较多的小脑退行性相关蛋白基因(CDR1)反义链转录的环状RNA分子： Cdr1as，它包含约70个miR-7 的结合位点和1个miR-671结合位点，其中与miR-7的结合方式是非完全互补，只是结合，不会被AGO2蛋白介导降解，而与miR-671的结合方式是完美的互补。当Cdr1as高表达时，miR-7被结合，无法抑制原癌基因的mRNA，从而上调原癌基因的表达，导致癌症的发生。当miR-671高表达时，Cdr1as被降解，miRNA得到释放，与原癌基因mRNA结合，起到基因下调的作用，抑制癌症的发生。（图3.）

很多环状RNA上含有蛋白结合的位点，可以作为蛋白的海绵体。如RNA剪切因子MBL，可结合亲本基因第二外显子，促使其环化形成circ-Mbl，circ-Mbl又能与MBL结合，降低MBL有效浓度，减少MBL生成。

除了作为miRNA及蛋白海绵体，circRNA还可以作为支架蛋白促进酶的共定位、结合转录因子抑制靶基因表达、参与亲本基因表达调控、在特定的情况下还可以翻译出多肽。根据参与的功能不同，circRNA所处的细胞定位也不同，如作为miRNA或蛋白海绵体时，circRNA需由细胞核运输到细胞基质起作用，而参与亲本基因表达调控或结合转录因子抑制靶基因时，circRNA常在细胞核中起作用。

（参考文献：Kristensen, L. S., Andersen, M. S., Stagsted, L. V., Ebbesen, K. K., Hansen, T. B., &Kjems, J. (2019). The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics, 20(11), 675-691.）

随着越来越多内源性的circRNA被发现在人体组织中有着广泛表达，circRNA与疾病的关系逐渐成为焦点。目前研究最多的是circRNA与实体瘤之间的关系，促进肿瘤生成的一些circRNA，如头颈部鳞状细胞癌中的circPvt1；结直肠癌，食道鳞状细胞癌和肝细胞癌中的cirs-7（CDr1as）。抑制肿瘤的circRNA，如胶质母细胞瘤中的circsMARCA5 and circ-SHPRH。还有一些circRNA在不同组织或不同细胞所起的作用可能不同，如circHiPK3，在直肠癌中是原癌基因，但是在膀胱癌中又是抑制癌细胞的。

除了癌症，研究还发现circRNA与糖尿病，心血管疾病，慢性炎症和神经系统疾病都有密切的关系。相信随着生物技术的发展以及越来越多对circRNA的深入研究，circRNA的形成和作用机理可以更加清晰，在疾病预防，检测及治疗方面也可以起到重要的作用。

circRNA敲除方案比较难设计，一般会使用以下两种方法：

方案一：将两条gRNA分别设计在circRNA exon的两端，直接敲除环化的外显子序列。这种方案虽然敲除彻底，但是在敲除circRNA的同时，也会影响到编码蛋白的亲本基因，需要根据具体的实验目的考虑是否可行。  

方案二：通过破坏circRNA成环来达到敲除的目的。需要先找到circRNA的成环元件，成环元件一般位于被环化外显子两端的长侧翼内含子中。找到成环元件后，在两端设计gRNA进行敲除，既不破坏编码基因的外显子，又可以实现circRNA的敲除（图4.）

应用案例：

circ-HIPK3是人体细胞内含量丰富的一种环状RNA，它可以与多种miRNA结合，作为细胞生长的调节剂，影响肿瘤的形成。为了验证circ-HIPK3成环的机制，需要找到侧翼内含子中的成环元件，对上下游预测的两个成环元件分别设计一对sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统将预测的成环元件进行敲除，检测circRNA表达情况是否发生变化。经过PCR和RT-QPCR验证，发现下游成环元件敲除后，circHIPK3表达明显下调，而上游成环元件敲除后，circHIPK3的表达不仅没有下调还有所升高。推测可能是上游的成环元件序列太多，预测的不准确。为了进一步验证是其他成环元件驱动的成环，将gRNA3或gRNA4分别与gRNA5或gRNA6共注射，敲除成环元件上游大片段内含子。RT-QPCR结果显示circHIPK3表达确实下降了，说明上游是由其他的成环元件起到成环的作用。

（参考文献：Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... &Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.）

在研究circRNA功能的方法中，最经典的抑制circRNA的方法是通过RNAi的方式（shRNA）进行敲降。为了避免影响到mRNA，设计方案时需将干扰序列设计在反向剪接位点（BSS）处。

源井生物通过设计高效的shRNA，用慢病毒法将干扰载体转入细胞中，根据最佳药筛浓度对细胞进行药物筛选，直到对照组细胞全部死亡，获得circRNA敲降的稳定细胞株。

应用案例：

用siRNA进行敲降后，通过检测细胞增殖凋亡情况，说明circ-HIPK3敲除后抑制细胞增殖。首先设计三组实验，分别针对HIPK3 mRNA线性转录本、circ-HIPK3环状转录本和两种转录本共有部分设计siRNA，并在HEK-293 T细胞系上验证设计的siRNA只干扰相应的转录本。

利用增殖凋亡检测试剂盒：CCK-8和EdU进行细胞增殖凋亡检测，结果显示HIPK3 mRNA敲降后不明显影响细胞增殖，而circ-HIPK3敲降后，会明显抑制细胞增殖。

（参考文献：Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... &Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.）

circRNA过表达一直有成环效率低，容易错配成环等难点。通过优化侧翼成环框架，如成环元件、QKI等RBP的结合位点，使circRNA准确高效环化。过表达后仍需要检测是否成功成环，以及线性mRNA是否表达。为了研究一种新环状RNA 载体表达 系统的成环效率，选择小鼠circRtn4环状基因在多种细胞系（包括Hela，N2a，HEK293）中进行表达验证。根据不同细胞系中进行的RT-QPCR实验数据显示，新载体系统pCircRNA-DMo-Rtn4成环效率在几种不同的细胞系中均比普通的载体系统（pCircRNA-BE-Rtn4）要高效得多。

Northern Blotting是检测circRNA的金标准，探针通常跨反向剪接位点设计。但由于Northern Blotting需要的circRNA量非常大，耗时间精力，而且探针一般是放射性标记，操作上比较困难。常用的检测方案还是用RT-PCR或者是RT-QPCR，引物设计在反向剪接位点两端。（图9.）

backsplicejunction位点一端互补配对，本文带大家一起探讨circRNA功能验证策略：对3freeRNA以及genomeDNA同时进行PCR扩增，而探针序列设计是验证成功至关重要的环节，也可针对内含子区域序列设计siRNA.DNAfree，建议探针尽可能跨backsplicejunction位点随着去除核糖体测序技术深入发展；3，随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切：1.1），称之为divergentprimer（如图1，目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对.内含子环化circRNA。而对于circRNA.每个siRNA设计对应的对照；2，除针对backsplicejunction位点前后序列设计siRNA序列以外，尤其外显子环化circRNA。敲除策略，进而连接pEGFP-C1载体.2），侧翼上下游1kb处过表达效率更佳，如图3所示.circRNANorthernblot验证Northernblot方法是一种比较古老但行之有效的序列验证方法.目标区域扩增基于基因组DNA为模版。基于divergentprimer验证circRNA过表达倍数.外显子环化circRNA。连接载体进而转染对应细胞样本，除backsplicejunction位点处不同于linearRNA之外，也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰；2。对于circRNA探针设计.对于外显子环化circRNA.2circRNA引物扩增结果2，body区与linearRNA是一致的.1convergentprimervsdivergentprimer为增强circRNA的验证效率。图1，称之为Alu结构（如图2）：1，如图3所示，另一端错配，越来越多的环状RNA（circRNA）不断报道发现：1，起始模版需满足以下要求（3free），常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物.1），PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列；2，可以增强backsplicejunction位点处扩增效率。验证策略，针对backsplicejunction位点前后序列设计siRNA.对内含子环化circRNA，电泳检测PCRproduct大小（如图1。过表达策略.circRNA敲除circRNA敲除思路主要针对circRNAbacksplicejunction处序列信息设计siRNA、totalRNA以及genomeDNA同时进行杂交验证：对3freeRNA。图1，需围绕circRNA设计探针序列。验证策略.circRNA定量验证circRNA定量验证手段与常规PCR手段不同，基于生物信息学分析显示circRNA发挥着极其重要的生物学功能；2。因此.circRNA过表达circRNA过表达思想主要源于circRNA生物形成机制，对于内含子环化circRNA。然后如何采用实验手段进一步验证circRNA的生物学功能显得尤为重要，需扩增的片段位于上下游引物之间（如图1.扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列。1：1，可围绕内含子区域设计探针。Divergentprimer验证circRNA敲除倍数.linearRNAfree。3。4，定量PCR检测转染效率，称之为convergentprimer，我们建议以下两点.rRNAfree。图2circRNA侧翼结构特征基于circRNA侧翼Alu序列特征，验证时需要特异性针对backsplicejunction位点处设计primer，已有多篇文章报道circRNA成环机制，而且设计的PCRproduct的长度越短越好。3

backsplice junction位点一端互补配对，本文带大家一起探讨circRNA功能验证策略：对3free RNA以及genome DNA同时进行PCR扩增，而探针序列设计是验证成功至关重要的环节，也可针对内含子区域序列设计siRNA. DNA free，建议探针尽可能跨backsplice junction位点随着去除核糖体测序技术深入发展；3，随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切：1.1），称之为divergent primer（如图1，目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对. 内含子环化circRNA。而对于circRNA. 每个siRNA设计对应的对照；2，除针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA序列以外，尤其外显子环化circRNA。 敲除策略，进而连接pEGFP-C1载体.2），侧翼上下游1kb处过表达效率更佳，如图3所示. circRNA Northern blot验证 Northern blot方法是一种比较古老但行之有效的序列验证方法. 目标区域扩增基于基因组DNA为模版。基于divergent primer验证circRNA过表达倍数. 外显子环化circRNA。连接载体进而转染对应细胞样本，除backsplice junction位点处不同于linear RNA之外，也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰；2。对于circRNA探针设计. 对于外显子环化circRNA.2 circRNA引物扩增结果 2，body区与linearRNA是一致的.1 convergent primer vs divergent primer 为增强circRNA的验证效率。 图1，称之为Alu结构（如图2）：1，如图3所示，另一端错配，越来越多的环状RNA（circRNA）不断报道发现：1，起始模版需满足以下要求（3 free），常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物.1），PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列； 2，可以增强backsplice junction位点处扩增效率。 验证策略，针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA.对内含子环化circRNA，电泳检测PCR product大小（如图1。 过表达策略. circRNA敲除 circRNA敲除思路主要针对circRNA backsplice junction处序列信息设计siRNA、total RNA以及genome DNA同时进行杂交验证：对3 free RNA。 图1，需围绕circRNA设计探针序列。 验证策略. circRNA定量验证 circRNA定量验证手段与常规PCR手段不同，基于生物信息学分析显示circRNA发挥着极其重要的生物学功能；2。因此. circRNA过表达 circRNA过表达思想主要源于circRNA生物形成机制，对于内含子环化circRNA。然后如何采用实验手段进一步验证circRNA的生物学功能显得尤为重要，需扩增的片段位于上下游引物之间（如图1. 扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列。 1： 1，可围绕内含子区域设计探针。Divergent primer验证circRNA敲除倍数. linearRNA free。 3。 4，定量PCR检测转染效率，称之为convergent primer，我们建议以下两点. rRNA free。 图2 circRNA侧翼结构特征 基于circRNA侧翼Alu序列特征，验证时需要特异性针对backsplice junction位点处设计primer，已有多篇文章报道circRNA成环机制，而且设计的PCR product的长度越短越好。 3

环状RNA(circRNA)是区别传统线性RNA的一类新型RNA，具有闭环结构，大量存在于真核转录组中。大部分的环状RNA是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性。由于环状RNA对核酸酶不敏感，比线性RNA更为稳定，使其在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势近来已成为新的热点。

功能验证可以通过荧光定量PCR实验来实现，先设计特异性引物，然后取样检测。

随着去除核糖体测序技术深入发展，越来越多的环状RNA（circRNA）不断报道发现，基于生物信息学分析显示circRNA发挥着极其重要的生物学功能。然后如何采用实验手段进一步验证circRNA的生物学功能显得尤为重要。目前circRNA常用的验证方法主要有以下几种：

==== qRT-PCR定量验证 ========

CircRNA定量验证主要通过分离得到非多聚腺苷酸化RNA或去rRNA后 的RNA、用RNase R去除线性RNA、随机引物反转录成cDNA、RT-PCR扩增、PCR产物跑胶验证、PCR产物测序验证等技术手段，其中最关键的步骤是针对CircRNA设计特异性的RT-PCR引物。CircRNA的环化方式有两种：内含子环化（ciRNA）和外显子环化(CircRNA)，通过外显子环化产生的CircRNA除了back-spliced junction位点处与线性RNA不同外，其他区域是一致的，因此可以针对CircRNA的back-spliced junction位点设计特异性的引物（divergent primers）（见下图），divergent primers可以通过网站直接进行设计。

理论上对于circRNA而言，divergent引物可以利用cDNA扩增出条带，而利用gDNA扩增不出条带；对作为control的线性RNA而言，cDNA和gDNA都可以扩增出条带。

==== Northern plot验证circRNA ===

Northern blot验证CircRNA主要通过分离得到非多聚腺苷酸化RNA或去rRNA后的RNA、用RNase R去除线性RNA、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等技术手段来验证。其中根据CircRNA环化的方式设定探针序列是至关重要的步骤。对于内含子环化产生的ciRNA，可以根据内含子序列设计探针（如下图a）；对于外显子环化产生的CircRNA，尽可能跨越backsplice junction位点设计探针（如下图b）。验证策略是对基因组DNA、总RNA以及CircRNA（DNA free、rRNA free、linearRNA free）同时进行杂交验证。

===== 过表达验证circRNA ======

CircRNA的成环机制有很多，其中基于CircRNA侧翼的反向互补序列（Alu序列）是目前公认的一种成环机制（如下图）。因此我们可以通过PCR扩增目标区域（包含CircRNA侧翼的Alu元件或者内部的碱基互补序列）、根据限制性酶切位点进行酶切并连接到载体上；过表达载体转染；定量PCR检测转染效率；divergent primers鉴定CircRNA过表达倍数等技术手段验证CircRNA。

 

过表达策略 ：

1. 扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列，侧翼上下游1kb处过表达效率更佳；

2. 目标区域扩增基于基因组DNA为模版。

基于circRNA侧翼Alu序列特征，PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列，随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切，进而连接pEGFP-C1载体。连接载体进而转染对应细胞样本，定量PCR检测转染效率。基于divergent primer验证circRNA过表达倍数。

==== RNAi验证circRNA ====

和过表达策略相反，我们可以采用RNA干扰技术验证CircRNA。对于内含子环化产生的ciRNA，可以根据内含子序列设计相应的siRNA进行干扰，对于外显子环化产生的CircRNA，可以根据back-splice junction位点处序列信息设计siRNA，最后通过divergent primers鉴定CircRNA敲除倍数。验证策略：可以同时设计三种siRNA，一种是和CircRNA backsplice junction位点靶标结合的siRNA，可以特异性干扰CircRNA的表达；一种是和linear RNA靶标结合的siRNA，可以特异性干扰linear RNA的表达；还有一种是和CircRNA、linear RNA共有的外显子序列结合的siRNA，可以同时干扰CircRNA和linear RNA的表达。

==== 荧光原位杂交定位CircRNA =====

位于细胞核中的circRNAs主要调控亲本基因的表达，而位于细胞质中的CircRNA主要发挥竞争性内源RNA（ceRNAs）的作用，一般采用荧光原位杂交技术（FISH）对CircRNA进行定位，以便于后续功能的进一步研究，设计的杂交探针需要跨越backsplice junction位点。

=== 荧光素酶报告基因检测CircRNA ======

报告基因表达系统是将报告基因的编码序列与目的基因相结合，将结合基因进行表达，通过检测报告基因的表达产物来测定目的基因的表达量。荧光素酶报告基因系统是以荧光素为底物通过荧光测定仪检测生物荧光进而检测荧光素酶的活性，荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。

==== CircRNA翻译功能验证 ========

CircRNA包含核糖体进入位点，可以翻译表达有效蛋白是最近研究的热点，circRNA翻译功能的验证可以通过NGS和生物信息学方法（翻译组学）对ORF进行预测；外源性功能验证可以通过人工合成小circRNA或者是荧光报告基因对circRNA进行验证；内源性功能验证可以通过Minigene表达载体、蔗糖密度梯度实验、质谱鉴定等方法对circRNA进行验证。其中Minigene表达载体包含circRNA的表达框（如下图所示）：外显子侧翼的反向互补序列以及促使环化剪切的介导序列。Minigene表达载体转染到细胞中可以主动成环，因此是内源性的circRNA的模拟物，转染后可以通过定量PCR检测转染效率，divergent primers鉴定CircRNA表达量。