如何快速设计shRNA
在研究基因功能中，RNAi由于可以特异地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验的强有力工具。其中shRNA慢病毒载体应用颇广，今天小编告诉大家2种方法可以快速设计构建到慢病毒载体中的shRNA。
1. Sigma网站
Sigma 公司做了一个针对人和小鼠的shRNA 库，而且部分基因的shRNA序列经过验证,因此直接使用Sigma 公司已验证过的RNAi 序列最为方便。
首先打开网址：http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/sirna/mission-predesigned-sirna.html，以Fli1为例，直接输入基因名，点击search，出现以下界面：
在Products中找到并点击shRNA选项，然后出现这个界面：
点击“MISSION shRNA Lentiviral Transduction Particles”这一行的PRICING，这时会弹出界面展示针对目的基因的shRNA：
当出现时，恭喜你，这个基因有被sigma验证过，下拉可以找到验证过的shRNA，用来构建慢病毒，简单有效，敲减效率基本上是有保证的。如果没有验证过的shRNA，则根据需要多选择几条shRNA也是一样能筛选到有效的靶点。提示：小编倾向选择CDS区的shRNA，3UTR基本不选，而且选择的每一条shRNA都会在NCBI上做BLAST，确保靶点是特异性的。Blast比对后最终确认选择下面2条FLI1基因的shRNA：
需要特别提醒，如果要构建到慢病毒载体上，合成出去的shRNA引物会根据载体有些不一样，sigma用的是pLKO.1载体，小编常用SBI的pGreenPuro(CMV) 载体，两端的酶切位点是BamHI/EcoRI，设计出去的引物最终是这样的（不同shRNA替换中间红色部分）：
Sense: GATCCCCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGTTTTTG
Anti-sense: AATTCAAAAACCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGG
2. Life Technologies网站
Life Technologies公司有个非常实用的在线shRNA设计软件，操作非常方便，而且设计出来的shRNA不再需要到NCBI上Blast，直接可以用的。
首先打开网站：http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/，在Target Design Options处选中shRNA，以Fli1为例，输入Accession number或Nucleotide sequence，其他条件不变：
下拉到底点击RNAi Design，然后出现推荐的10条靶点序列：
根据Rank评星，选择其中需要的（翠花一般选择4条，不同位置各一条），点击Design shRNA Oligos：
然后在Default Loop Sequence选择合适的序列（翠花用的载体是pGreenPuro，不需要这个序列，就默认了，后面合成引物的时候要去掉的），在Custom Loop Sequence处输入CTCGAG，点击Design：
得到shRNA
提醒：合成出去的引物需要做微调，根据载体的要求，和sigma的设计一样，需要在前后加上酶切位点的，最后大功告成。
追问：你能发个样子过来吗谢谢回答：=.=这样你感觉可以不？追问：不好看你可不可以再帮忙想一个啊拜托了回答：=。=斤追问：T-T这个你感觉好看吗回答：请问你是给什么东西设计品牌呢？=。=我感觉这有点土追问：给自己纹因为我的名字里面有婷婷所以我想纹这两个字的打头字母回答：=.=这个怎么样。其寓意上得厅堂不斤斤计较的性格比较适合追问：这个我感觉也很好不会感觉很土对吗回答：我觉得不算土。。我给你全面分析一下吧。。一个大的T下面一个小的t代表有坚强的一也有脆弱的一面=。=。。其意则是用坚强的一面来遮盖其弱小的一面=。=有人会把它读成厅字也能读成斤字。其寓意都是同上面那一条上得厅堂，斤字则略显大气拥有非一般女子的胸怀=。=当别人问起来你可以说的头头是道。
从上面的图上我们可以看出，中间的绿色部分就是最终形成茎环的部分，左侧的红色部分序列是CCGG，与右侧的橘色部分是TTTTTG，这两个序列都是与pLKO-puro载体连接的部分，其中CCGG是AgeI酶切位点的粘性末端，TTTTTG则是保证了shRNA转录出来后，其末端是连续的4个U，即UUUU。蓝色与红色部分的黑色字母标注的部分则是与FLCN的CDS互补的序列。
以FLCN这个基因为例，第1条链基本上都可以在Sigma的官网上查到，现在我们设计第1条shRNA的 反义链 序列，前面提到，pLK-puro空载体上用于连接shRNA的两个酶切位点是AgeI与EcoRI，因此在设计反义链的时候，需要添加上EcoRI的酶切位点的粘性末端，如下所示：
正义链：5‘ --- CCGG GATGGAGAAGCTCGCTGATTT <mark >CTCGAG</mark> AAATCAGCGAGCTTCTCCATC<mark >TTTTTG</mark>--- 3’
反义链：5‘ --- AATT <mark >CAAAAA</mark>GATGGAGAAGCTCGCTGATTT <mark >CTCGAG</mark> AAATCAGCGAGCTTCTCCATC --- 3‘
(1)从距离上量化，即控制室距离装置多少米可以采用非抗爆结构。装置的爆炸力与装置的规模大小、物料特性、操作条件等诸多因素有关，需要安全专业进行抗爆强度计算，距离相同时，不同装置所产生的爆炸力不同，因此采用距离区分是否抗爆缺乏依据。
(2) 爆炸力的量化，即装置的爆炸力小于多少mbar 可以采用非抗爆结构。由于目前建筑专业无从验证不同量值的爆炸力与建筑物不同破坏程度之间的对应关系，因而无法确定抗爆结构的爆炸力限值。
当没有对装置爆炸冲击波参数进行评估时，可按照现行行业标准《石油化工控制室抗爆设计规范)) SH/T 3160~2009 第6. 3. 1 条执行。
然后在用代码控制他 比如当你按下按钮后就隐藏这个mc
btn1.addEventListener(MouseEvent.CLICK,onclick1)
function onclick1(e:MouseEvent):void{
mc.visible=false//隐藏按钮
}
btn2.addEventListener(MouseEvent.CLICK,onclick2)
function onclick2(e:MouseEvent):void{
mc.visible=true//显示按钮
}
注意按钮1和按钮2的名称根据你的按钮名称来决定（也就是这里的btn1和btn2）
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