实时荧光定量pcr引物怎么设计

一、方法不同

1、普通pcr引物设计：引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

2、荧光定量pcr引物设计：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度

二、原理不同

1、普通pcr引物设计：为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

2、荧光定量pcr引物设计：在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。

三、注意事项不同

1、普通pcr引物设计：引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。引物长度在15~30碱基之间。

2、荧光定量pcr引物设计：实时荧光定量 PCR 仪应安放在湿度较低、灰尘较少、远离水池的平稳台面上，不能有强光直射，室内应通风良好，无腐蚀性气体

参考资料来源：百度百科-荧光定量PCR

参考资料来源：百度百科-PCR引物设计

引物设计参数：

a

引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。

b

引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3，primer

5，primer

6，primer

express等一般可以设置在55-58度，beacon

design可以设置在65左右。

c

GC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。

d

产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不易区分，超过200bp可能会影响PCR扩增效率。

e

软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。

f

引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。

参照以下real-time PCR引物设计原则：

1.最好位于编码区5’端的300-400bp区域内,可以用DNAman,Alignment 软件看看结果.

2.产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）.

3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大.

4.G+C含量在40%~60%之间,45-55％最佳.

5.碱基要随机分布,尽量均匀.

6.引物自身不能有连续4个碱基的互补.

7.引物之间不能有连续4个碱基的互补.

8.引物5′端可以修饰.

9.3’端不要以A结尾,3′端不可修饰,而且要避开AT,GC rich的区域,避开T/C,A/G连续结构（2-3个）.

10.引物3′端要避开密码子的第3位.

11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端,且3‘端自由能最好小于9KJ/mol.可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况.

12.做荧光定量产物长度80-150bp最好,最长是300bp.

13.引物设计避免DNA污染,最好跨外显子接头区.

14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源.

15.查看有无假基因的存在.假基因就是无功能的DNA序列,与需要扩增的目的片段长度相似.

16.TM值在55-63度之间.

17..引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源.

引物 荧光定量PCR 是利用荧光定量PCR 仪（如ABI 7500、stepone、ROChe LightCycler、Bio-Rad CFX96 等）通过实时追踪 PCR 每一步循环的荧光信号 值来达到对起始模板量的定量分析。一次成功的荧光定量 PCR 反应除了需要稳 定的仪器、优质的 Taq 酶、比较好的模板质量，更需要高质量的引物对。想要 得要高质量的引物对的前提是引物的设计必须要精益求精。下面我们以人IL6 因为例（以人IL6基因mRNA 序列作为模板设计引物），给大家讲解如何进行高 质量的引物设计。 （1）利用 NCBI 数据库，查询基因的序列。登录 NCBI 官方主页： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。在栏目项中选择“Gene”，关键词输入“IL6 homo”，具体如下所示，点击“Search”。（2）结果如下，一般第一条基因即为所要查询的基因，这里需要注意“Aliases” 一栏，因为很多基因有很多别名，在查询时需要注意。明确基因后，直接点击 ，进入人IL6 基因的主页。 上海捷瑞生物工程有限公司（3）进入人 IL6 基因的主页后，往下拉动网页，看到如下界面。由于我们设计 引物的模板是mRNA，所以我们要找到该基因的转录本信息。点击“reference sequence details”。 （4）得到如下界面，我们看到，人IL6 基因在NCBI 里的记录是2 个转录本， 我们在设计引物时，除非需要检测某个特定的转录本，一般的做法是将该基因所 有的转录本序列进行比对分析，找到他们共有的序列区域，选择该共有区域作为 模板设计引物，这样设计的引物就能尽可能的扩增出该基因的所有mRNA 信息。 针对IL6 基因，我们分别点击“NM_000600.4”和“NM_001318095.1”打 开这两个转录本信息。 上海捷瑞生物工程有限公司（5）我们看到，人IL6 基因的两个转录本序列大小不一样，分别为1197bp 1006bp。我们将这两条mRNA序列复制到比对软件（如BIOEDIT 用软件对这两条序列进行比对分析。（6）比对结果如下，从比对结果看出，这两条序列前后均一致，只有转录本2 在141-331bp 处发生了缺失，我们选择共有区域331bp-1197bp 的序列作为 上海捷瑞生物工程有限公司模板设计引物。 （7）将这段共有序列复制到引物设计软件中，引物设计的软件很多，比如 Primer premier6.0、Oligo7.37、在线Primer3、Beacon Designer、在线NCBI Primer-BLAST 等。不同的引物设计软件的工作原理大同小异，基本都具备引物 设计的基本原则（后面列出），但是对引物Tm值的计算结果不同的软件可能有 差异，这主要跟计算方法有关。捷瑞生物提供免费的引物设计服务，所使用的设 计软件是自主开发，并自主运行ePCR（电子PCR），具备引物BLAST 功能，尽 量选择最优化的引物对。下面以在线NCBI Primer-BLAST 为例，说明引物的设 计过程。 （8）打开在线NCBI Primer-BLAST 。将序列复制到制定的位置，如下图。在“PCR product size”选择 Min“80”；Max“250”（荧光定量PCR 产物的大小尽量不要很大，保证PCR 扩增的效率）。在“Database”一栏选择mRNA 数据库（一般默认为Refseq mRNA）。在“Organism”一栏选择物种是人（一般默认为Homo sapiens）。 一切设置好后，点击“Get Primers”即可。 上海捷瑞生物工程有限公司（9）打开后会出现以下选择项，需要观察这段序列是否属于所要设计的基因序 列，这里直接点击“Submit”即可。 （10）得到如下结果，图中给出所设计的引物的上下游引物位置；具体的某一 对引物的参数；该对引物的ePCR 结果等。考察一对引物质量是否理论上优异， 需要看如下几个方面：引物Tm值一致，尽量在60左右；引物尽量无发卡结 构二聚体等；ePCR 产物尽量单一，尽量无非特异性产物等。 上海捷瑞生物工程有限公司（11）至此，引物设计的工作就结束了，接下来就是将设计的引物序列发送到 引物合成公司合成，在拿到引物成品后，按照仪器和相关试剂盒说明书做预实验， 调试引物的质量。理论上，选择再优的引物对，只有且只能通过真实的实验验证， 才能100%确定该对引物是否能用。在做荧光定量P CR 实验时，对引物扩增效 率的测试非常的重要，这块后续我们再具体探讨。 （12）荧光定量PCR 引物设计的一般原则： PCR产物的长度在70-300bp 之间，避免产物太长导致PCR 扩增效率降低， 影响定量结果； 引物设计的区域尽量选择在mRNA的3’段，尽量保证扩增的产物为该基因 所表达的全部mRNA 信息； 如果一个基因有很多转录本，尽量选择他们的共有序列为模板来设计引物，保证扩增产物的稳定性； 引物尽量避免发卡结构、二聚体结构、非特异性扩增产物、引物Tm值不一致、引物序列中有连续4 个碱基以上的Poly 结构等等； 总之，理论上再好的引物对，只有通过真实的实验验证才能判断其是否能用、好用。

1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp

2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；

4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0；

5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；

6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；

7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；

8、3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配；

9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；

10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；

11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；

12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。

13、对引物的修饰一般在5'端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。

1，PCR引物是利用碱基互补原则，通过找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

2，首先要找到你用来设计引物的目的基因全序列，一般NCBI、Genebank上都能找得到。

3，引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导 致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；引物3’端尽量不要出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，这样会会增加错配几率，3’端尽量不要以A为结尾； 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大； ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳 定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应；对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物 的载体的相应序列而确定。