| 中文名称 | 脉冲场凝胶电泳 | 外文名称 | PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis |
|---|---|---|---|
| 定义 | 是分离大分子DNA的方法 | 分离范围 | 大小从10kb到10Mb的DNA分子 |
| 制备加工 | 详见正文 | ||
1.以TE缓冲液悬浮λ多联体(Boehringer MA宝灵曼公司产品)，浓度为4μg/40μl。
2.用等体积TE配制的2%低熔点琼脂糖(温度保持在45℃)混匀。
3.移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。
4.室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。
| 市场价 | 信息价 | 询价 |
1.将0.8%的琼脂糖在0.25×TBE中熔化后冷却至50~60℃，立即注入凝胶框架中，并插入梳子。
2.凝胶固化后小心地拔出齿梳，用2把无菌手术刀将DNA凝胶块上样。若用不同内切酶消化凝胶块，则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷却。将DNA大小标志物上样至凝胶的两旁。
3.用1%液态低熔点琼脂糖凝胶(0.25×TBE配制)密封狭槽。
4.若有气泡存在，用注射器驱赶气泡。
5.一旦密封的低熔点琼脂糖已固化(大约10min)，可将凝胶搁入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面。
6.应设定合适的电压及转换时间(参考《分子医学技术》84页表8.1)并开始电泳。两个不同电泳方向的电流应相等。
7.电泳结束后，凝胶用0.25×TBE配制成的EB(0.4μg/ml)染色。
8.用泵自槽中排除缓冲液，续以双蒸水冲洗电泳槽。
9.凝胶成像:DNA在曝光的过程中可能会形成缺口。
10. 用0.25mol/L HCl漂洗凝胶30min，让DNA脱嘌呤，并有利于转移。
11. 凝胶用碱(变性溶液中)变性20min，两次，续以中性溶液1~5min。
12. 采用标准Southern印迹方案将DNA转印至尼龙膜上。一般来说，印迹PFGE凝胶的时间较普通凝胶印迹时间长(约48h)。
1.收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。
2.2000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。
3.稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。
4.用PBS重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例(1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg)
5.用PBS配制2%浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。
6.将等体积(各1ml)细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。
7.静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯(通常用作划菌)将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。
8.将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2~3天。每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。
9.蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。
10. 此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。
11. 将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。
12. 室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次，将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L
EDTA，(pH8.0)4℃保存凝胶块。
13. 若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。
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1.应使用消毒溶液及戴无菌手套以免DNA降解。
2.在Falcon试管中用1×TE溶液漂洗凝胶块20min 3次，以去除EDTA。
3.混合:酶反应缓冲液(高、中或低盐缓冲液)，100
mmol/L亚精胺(只用于高盐缓冲液状态)，10~20单位的内切酶。20单位的内切酶就足以过夜完全消化10μg DNA。
4.设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照，以检查是否有非特异性DNA降解。
5.将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中:通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入。
6.若两种内切酶所需缓冲液条件一致，可以同时或先后用两种不同的酶进行消化(先用低盐缓冲液的酶消化，再调整盐浓度)。倘若首次消化的酶要求50℃条件，在第二个酶消化时要换缓冲液。
7.若要进行部分消化，则首先在同一温度和反应时间用1:10稀释的酶进行尝试。
聚丙酰胺凝胶电泳
中性聚丙烯酰胺凝胶电泳
安装电泳装置和配制凝胶溶液
以凝胶(如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶
等)为支撑物的区带电泳。
凝胶电泳被广泛用于分子生物学、遗传学和生物化学:1.大的DNA或者RNA分子通常利用琼脂糖凝胶电泳(aGARose gel electrophoresis)分离，也可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。2.蛋白质的凝胶电泳通常在加入十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行(SDS-PAGE)，或者非变性凝胶电泳，或二维电泳。 SDS-PAGE 蛋白质凝胶电泳图。 3.毛细管电泳 4.酶谱
法(zymography) 5.变性梯度胶凝电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE) 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
1、 DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
2、 琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、DNA分子的构象
DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而开环双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
一般从DNA、RNA和蛋白质这三个方面鉴定。将三种物质分别提取出来，各自进行鉴定。鉴定的方法可以用你提到的这些。
1核酸杂交：简单的说，就是将需检测的核酸与标记的分子结合使得未知核酸可以被检测到。
2脉冲场凝胶电泳：利用电场让不同大小的带电DNA分子以不同的速度移动，从而将不同大小的分子分开。可分离10kb--10mb的DNA分子。
316S rRNA :16S rRNA所对应的 16S rDNA基因在微生物基因组中具有高度保守性；对16S rDNA而言，如果出现3个碱基以上的差异就可以断定细菌不属于同一种属。它具有高度的灵敏性，而且不需要培养，检测指标也很单一。可以快速检测未知微生物或致病微生物。
4RAPD：对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。先进行PCR扩增，然后电泳分离染色，在紫外透视仪上检测多态性。
5质粒质谱分析法：我只了解过蛋白质的质谱分析技术，质粒的没有了解过。
蛋白质：将蛋白质酶解成小肽段并混合基质，用激光将呈离子化气体状态的待测物喷射，经电场到达检测器，根据到达的时间分析肽段的分子质量。
对木霉核型的研究集中于20世纪90年代，研究者利用分子生物学手段对几种典型木霉的染色体条带数量、大小及基因的定位进行了分析。另外，有学者对哈茨木霉（Tharzianum）中细胞核在不同位置及生长阶段的形态特征进行了详细报道。
Mantyla等（1992）利用CHEF（Contour-clamped Homogeneous Electric Field）凝胶电泳方法对长枝木霉（Tlongibrachiatum）进行了核型分类研究，发现野生型Tlongibrachiatum菌株QM6a具有7条染色体电泳条带，大小为28～69Mb，估计整个基因组的大小为33Mb，研究还发现纤维素酶编码基因cbh1，cbh2和egl2位于同一个连锁群（野生型的染色体Ⅱ上），而内切葡聚糖酶编码基因egl1则位于另外一条染色体上（野生型的染色体Ⅵ上）。Carter等（1992）利用脉冲场凝胶电泳技术研究了里氏木霉（Treesei）菌株QM6a及其几个衍生菌株的染色体，也发现菌株都具有7条染色体，全基因组大小为33Mb；每条染色体的大小为32～62Mb。Herrera-Estrella等（1993）利用CHEF和旋转电极电泳技术研究了Tharzianum，Tviride和Treesei三种木霉的染色体及相关基因的定位。在Tharzianum和Treesei中发现了6条染色体带，在Tviride中发现了5条。这些染色体的大小为22～74Mb，估计全基因组大小在31～39Mb之间。Hayes等（1994）发展了木霉核型分类技术，能够从活的原生质体中分离并观察完整的染色体。利用该技术研究了Tharzianum菌株T12 his-2和T95 lys-1，以及两者的原生质体原养型融合子1295-22，发现T95 lys-1有4条染色体，大小为22～54Mb，而菌株T12 his-2和1295-22则只有两条染色体，三个菌株各自的最大染色体相似，大小为54Mb左右。Go-mez等（1997）利用CHEF凝胶电泳方法研究了Tharzianum菌株的遗传多样性及菌株之间的营养体相容性，发现全基因组大小为296～561Mb。同一核型之间能产生菌丝融合。研究者利用脉冲场电泳技术发现5个种类的木霉（含钩状木霉Thamatum）都含有6条染色体，大小为37～77Mb，全基因组大小为305～358Mb，还发现42 KDa几丁质酶编码基因位于不同的木霉属染色体位置上（Csaba et al，1996；杨合同，2009）。
研究表明，几乎所有的木霉细胞是多核的（Harman，1993），Kubicek等（1998）利用吉姆萨（Giemsa）染色法（Shirane et al，1989）观察了已市场化的生防木霉Tharzianum菌株1295-22的菌体内细胞核，并对其核内特定信息进行报道。研究中，为了取得良好的细胞核和菌丝染色特征差异，对不同的样品采用了多样化的染色时间（图91）。染色结果显示，细胞核的大小和数量在菌体内的不同部分有显著的不同。研究者在对生长于葡萄糖琼脂培养基上成熟菌丝的边缘及分生孢子刚刚开始形成的区域进行了重新测试，观察发现菌丝具有明显大小不同的尺寸，较大的大约有直径10μm，而较小的只有大约3μm（图91 A，B），还有几个菌丝直径大小介于两者之间为5μm。这种菌丝的多样性之前在木霉中描述过，其中只有小菌丝涉及重寄生。这些菌丝都是多核的：较小的菌丝每个细胞含有5～6个细胞核，而较大的细胞有非常多的细胞核，有的细胞会超过50个（图91A，B）。此外，不同位置的细胞核组具有不同的外观。有一些呈圆形，而其他的，大多是组合在一起的，外形显著拉长（图91C）。这些拉长的细胞核均面向菌丝的长轴，并排列成V字形。在其他真菌中也存在这样被拉长的细胞核，是由于细胞骨架分子的行动导致运动型细胞核迁移到其他地方（Aist et al，1967），在哈茨木霉中很可能是同样的情况（图91C）。其中，瓶梗柄含有较少密集型核子簇，只在支撑菌丝的交界处和瓶梗的最低端有一到两个。分生孢子形成的烧瓶状细胞中包含一个单一的细胞核（图91D），显然是为了给新形成的孢子提供一个单一的细胞核。新生的分生孢子大多是单核的（图91E），虽然比较成熟的分生孢子可能是多核的（Stasz et al，1988b），然而，这些细胞内可以看到细胞核有丝分裂，而且有丝分裂后的分生孢子会进行细胞分裂生成两个分生孢子（图91E）。这种细胞分裂并没有在木霉或者其他真菌分生孢子中被描述过。研究还观察到萌发孢子形成了新的菌丝，这些新形成的菌丝都是直径较小和胞内多核的，每个细胞都有两到三个细胞核（图91F）。然而，在菌丝尖端细胞核的数量要大于菌丝链的其余部分，而且根据它们的大小和染色的密度，菌丝尖似乎具有多个细胞核（图91F）。
SDS-PAGE跑电泳时，跑到浓缩胶和分离胶分界处时一般是要换电压的。
对于分子量十分大的片段，可以用脉冲场凝胶电泳。也可以延长电泳时间（此时前面的小分子DNA可能会跑出胶外。如果你要的只是大片段，延长电泳时间还是可行的。毕竟脉冲场凝胶电泳要特殊设备。
试剂准备：
1、SDS-PAGE试剂：见电泳实验。
2、匀浆缓冲液：10M Tris-HCl(pH 68)10ml；10%SDS 60ml；β-巯基乙醇 02ml；ddH2O 28ml。
3、转膜缓冲液：甘氨酸 29g；Tris 58g；SDS 037g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4、001M PBS(pH74)：NaCl 80g；KCl 02g；Na2HPO4 144g；KH2PO4 024g；加ddH2O至1000ml。
5、膜染色液：考马斯亮蓝 02g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉10g 溶于20ml的001M PBS中。
胶分辨率不够 大片段运动时速度很慢,片段之间的距离就拉不开,肉眼也看不清条带
对于分子量十分大的片段,可以用脉冲场凝胶电泳也可以延长电泳时间（此时前面的小分子DNA可能会跑出胶外如果你要的只是大片段,延长电泳时间还是可行的毕竟脉冲场凝胶电泳要特殊设备,麻烦）
