| 中文名称 | 双向电泳 | 外文名称 | two-dimensional electrophoresis,2-DE |
|---|---|---|---|
| 组成 | 等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合 | 研究方向 | 蛋白质组研究 |
| 创建者 | O'Farrell's | 创建时间 | 1975 |
重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗?
一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。
为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面?
通常情况下，等点聚焦中体系内除了蛋白质还会存在少量带电小分子，当这些带电小分子在电场中向两极运动时，会带动胶条中的水分子运动，水分子运动会带动附近的覆盖油移动，当样品质量不高，带电小分子较多时，会导致覆盖油移动严重溢出胶条槽，此时，通常会伴随胶条的酸性端胶条厚度增加。当发生覆盖油溢出或胶条暴露时，应及时补加覆盖油。为了防止这个现象的发生，应从样品制备时严格控制样品质量，尽量减少带电小分子如盐离子的含量。同时可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量(80 %满)的覆盖油。
跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)?
电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，修饰蛋白，从而对等电聚焦产生影响。
跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高?
刚开始时，体系内的带电小分子比较多(比如无机盐和双极性分子)。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时(无机盐移动到极性相反的电极;两性分子移动到对应的 pH 条带)，体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动，而蛋白质运动需要较高的电压。
跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动?
蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时(pH4)，颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。
跑第一向时，为什么电压总达不到预定值?
当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。
跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低?
当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。
跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生?
等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中性分子。这时加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么?
硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。
怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值?
可以根据胶条的pH范围和长度估算蛋白质点的pI值，在第二向中加入分子量MaRKEr估算蛋白质点分子量。也可以用体系内已知蛋白来做比对。
为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾?
横的脱尾可能是:1)一向等电聚焦不完全; 2)某些蛋白质本身的原因(糖蛋白); 3)蛋白的丰度太高。竖的脱尾可能是1)平衡时碘乙酰胺量不足;2)跑二向时，蛋白的溶解度不好。
什么成分会影响 2D 胶的效果?
核酸，盐，去垢剂等等。
2D 胶的上样量应该在什么范围?
上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在 100 微克(银染)到 500 微克(考染)之间。
我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩?
蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少(被膜所吸附)。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来(丢失)。沉淀法中，又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境(不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液)，然后再进行超滤。
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第一向等电聚焦
⒈ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT，不含IPG buffer)一小管(1ml/管)，置室温溶解。
⒉ 在小管中加入0.01g DTT， 0.5% 对应胶条pH范围的IPG buffer，充分混匀。
⒊ 从小管中取出400微升水化上样缓冲液，加入100微升样品(考马斯亮蓝染色需样品1mg，银染需300μg)，充分混匀。
⒋ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟。
⒌ 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
⒍ 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
⒎ 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
⒏ 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
⒐ 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。
⒑聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
第二向SDS-PAGE电泳
⒈ 装配灌胶模具，配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配200ml凝胶溶液，每块凝胶50ml，将溶液沿灌胶模具背面槽道倒入，直至溶液到距离玻璃板1cm停止，用75%乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟后，凝胶与上方液体分层，表明凝胶已基本聚合，建议聚合3-5h使凝胶完全聚合。
⒉ 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。
⒊ 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其恢复至室温。
⒋ 配制胶条平衡缓冲液I(含DTT)。
5.在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
⒍ 将胶条转移至平衡管或溶胀盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5-10ml胶条平衡缓冲液I。将平衡管或溶胀盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
⒎ 配制胶条平衡缓冲液Ⅱ(含碘乙酰胺)。
⒏ 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
⒐ 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。
⒑将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解。
⒒将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。
⒓第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅱ。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。
⒔将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。
⒕将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
⒖用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。
⒗放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
⒘在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。
⒙在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低功率(1W/gel/18-24cm)或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流(或电压)(13-15W/gel/18-24cm)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
⒚电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号(戴手套，防止污染胶面)。
⒛进行染色。
目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.
样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换.三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP)取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加]. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎]等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失]. 此外，低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的"冰山之尖"，故分离低丰度蛋白是一种挑战.亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1~15 mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点. 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生?0~10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.
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分离后的斑点检测(spot detection)亦很重要. 所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术.银染已成为一种检测2-DE的流行方法，可检测少到2~5ng的蛋白，因此较考马斯亮蓝R-250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，一些有机染料不适于PVDF膜.放射性标记不依赖其代谢的活性，并仅适于对合成的蛋白质检测. 另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳)，即应用两种不同的染料荧光标记两个样品，使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个，避免了几种2-DE的比较，可在纳克级进行检测.
较早期相比，2-DE有两个主要的进步:首先，极高的重复性使有机体的参考图谱，可通过Internet获得，来比较不同组织类型、不同状态的基因表达;其次，高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.
Bio-Rad双向电泳装置
特点:可同时运行四块凝胶，多种胶长度选择，内置冷却芯，不同孔数和梳子选择。
用途:适用于一系列电泳，如SDS-PAGE,双向电泳的一向和二向，Native电泳，制备电泳，梯度电泳及高分辨率的核酸琼脂糖电泳等。
1、 样品新鲜。
说明:组织样本及细胞采样后应立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂，运输过程中血液、血清样品4℃保存，其它样品-20℃保存，不超过48小时(若外地邮寄，除血液、血清及细胞外请用干冰)。
2、 样品蛋白的总量不少于1mg。
说明:组织样本每份约250-500mg;
细胞样品每份106-107细胞数(一块胶);
血液、血清等样品大于5mL，且不能溶血;
蛋白提取物要求蛋白浓度大于5mg/mL，总量不少于1mg，且均匀无沉淀，样品中无盐成分;
植物或真菌样品量湿重不少于2g;
富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于3g 。
1、建议使用的蛋白质溶解体系为8M尿素/4%CHAPS /40mMTris(base)/65mM DTT;
2、样品浓度大于2 μg/ μl;
1、根据蛋白质的等电点(第一向)和分子量(第二向)的不同进行分离。
2、电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色，然后用相关软件对电泳图象进行分析。
1、建议使用的蛋白质溶解体系为8M尿素/4%CHAPS /40mMTris（Base）/65mM DTT；
2、样品浓度大于2 μg/ μl； 等电聚焦
蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。 SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳
双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS．PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。
蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质．SDS复合物，由于SDS是一种强阴离子去垢剂．所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响．而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系，在蛋白质组研究中。需要在同样的条件下同时走多块胶，这对凝胶与凝胶之间的比较十分重要。 分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范围（如005U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。
其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。有文献报道，N末端4个残基序列的数据就可以给出很多的信息而得到相当准确的结果。如再结合C末端序列，判断结果的准确性会更高。对分离得到的蛋白质作进一步的确切鉴定需要有足够数量的纯蛋白，电泳时蛋白质已经过了高度纯化。现在一块胶板可允许上到高达mg数量级的样品，因此每个分离的蛋白斑点可有μg数量的蛋白，这样使本来是微量的蛋白也可希冀被鉴定。
蛋白双向电泳是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳，然后再进行SDS-PAGE，经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
蛋白双向电泳分析的主要技术难点是高分辨率和重复性。高分辨率确保蛋白最大程度的分离，高重复性允许进行凝胶间配比。第一向应用载体两性电解质，在管胶内建立pH梯度，随着聚焦时间的延长，pH梯度不稳，易产生阴极漂移。在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成，但很难控制。
差异凝胶双向电泳(DIGE)是用于检测蛋白表达中真实的生物学差异并对差异进行定量的方法。它结合了蛋白组学研究中经典的双向电泳技术和特有的多重荧光分析技术。楼主可以到生物帮那里找这方面的文章，我看到过一篇DIGE的技术原理以及其多方面的应用的文章不错的，你可以去看看。生物帮是生物行业门户网站，有丰富的生命科学领域产品、技术文档、视频资源。参考： httttp://>
双向电泳技术发展迅速，目前是蛋白质组学中应用最广泛的蛋白质分离手段。样本制备方法对于获得清晰度高的电泳结果至关重要，然而最佳的样本制备方法需要考虑样本特点及研究目的。
你是如何处理双向电泳样本的？分享一下你在双向电泳实验中成功或失败的经历。
荧光双向电泳DIGE做差异点分析的时候比考染好。
总蛋白的双向电泳，考染显色，跑出来的效果不太好，蛋白点不多，各点之间分得也不太开，我的上样量是不是偏少，第一向等点聚焦是不是不完全或者是样品不纯？
个人认为急需整理各种组织的高效的处理方法，酚抽法麻烦耗时有时效果却不见得比TCA丙酮好，着实让人郁闷。
植物组织样品处理一般情况下用简单的TCA/丙酮提取法或酚抽提法。如果提取蛋白的效果不佳，可用TCA/丙酮/酚抽提法 来提取蛋白。
双向电泳时，血清样本怎么处理比较好，听说很多种处理方法，但效果不太一样。
双向凝胶电泳的样品制备影响因素挺多的，包括蛋白质的溶解性、分子量、电荷数等等，我之前做实验的时候对于蛋白提取的marker是有要求的，marker需要根据目的基因及载体的分子量再来确定的。
说起双向的电泳，满满的都是泪啊，胶的浓度、电压、气泡、时间因素多了去了，还记得等待的时候去吃饭打球的日子吗，跑过头了亲，过头了亲，头了亲，了亲，亲其实吧，天气也是要注意的。
有一段时间没做这个实验了，之前我处理样本的经验就是：老老实实按照实验步骤走，洗干净手。这样基本就没有 太大的问题。
我刚做蛋白不久,我的粗酶液是葡聚糖酶,经过PAGE电泳后活性染色,有三条红色条带,其中一条带比较亮我将亮红色条带相对应位置的胶回收,进行SDS-PAGE,考染有三条带,而且离的比较近 我现在想做双向电泳,看看我的葡聚糖酶的等电点,请问我要准备些什么,要将我的酶液怎么处理吗
等电聚焦的时候，电压老是上不去。怎么破？是样品处理的问题吗？
蛋白质类混合物适合用什么方法分析
1、电泳：在外电场的作用下，带点颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋白质和核苷酸等生物分子的分析分离和制备。 区带电泳是由于在支持物上电泳蛋白质混合物被分离为若干区带。
电泳前用缓冲液浸润薄膜或滤纸等支持物或用缓冲液直接配置成凝胶，将待分离的蛋白质样品加在它的一端或中央，支持物的两端与电极连接，通电电泳。电泳完毕，各个组分分布在不同的区域，用显色剂（蛋白质可用考马斯亮蓝或氨基黑等染色）显色后可以显示出各个组分。
氨基酸混合物特别是寡聚核苷酸混合物一次电泳往往不能完全分开。这种情况可以将第一次电泳分开的斑点通过支持介质间的接触印迹转移到第二个支持介质上，旋转90°，进行第二次电泳。这种方法称为双向电泳。
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的两部分组成（小的部分是浓缩胶，大的部分为分离胶），这两部分凝胶的浓度、缓冲液组分和离子强度、pH以及电场强度都是不同的，即不连续性。电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带，然后再进行电泳分离。 电泳有三种物理效应：1、样品的浓度效应；2、凝胶对被分离分子的筛选效应；3、一般电泳分离的电荷效应。
3、毛细管电泳：高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳、毛细管电泳，可分离氨基酸、肽、蛋白质、DNA片段和核酸以及多种小分子，也可用于手性化合物的分离。
毛细管减少了由于热效应产生的许多问题，可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入稳定介质即可进行自由流动电泳。
电泳迁移引起溶液中荷电分子向相反电荷的电极移动，虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而电渗作用使溶液向负极流动，而且电渗电流很强，其速度一般比样品的电泳速率答，因此所有的正、负离子和中性分子都被推向负极。对荷正电分子来说，电泳迁移和电渗流效果是一致的，而且移动最快，最先达到负极。随着被分离的分子接近负极，它们都将通过紫外检测器并把信号传递给记录仪。所得结果是被分离组分的紫外吸收对时间的峰谱。
4、等点聚焦（IEF）分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的梯度处，并形成一个很窄的区带。
pH梯度制作一般利用两性电解质，它是脂肪族多胺和多羧类的同系物，它们具有相近但不相同的解离常数和等电点。在外电场作用下，自然形成pH梯度。
5、层析聚焦：根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
原理：当用特种缓冲液滴洗填充在柱中的特种多缓冲交换剂时，就会在层析柱中自上而下自动的建立起连续的pH梯度；同时加在柱上端的蛋白质样品也随多缓冲液的展开按各自的等电点聚焦在相应的pH区段。并在展开过程中随pH梯度下移，蛋白质混合物的各组分先后从柱中流出，达到分离纯化的目的。
1， 提取蛋白的时候要充分超声粉碎，然后高速离心。吸取上清的时候不要触到沉淀。污染不一定是RNA和DNA，还有可能是胶里面有杂质。
2 遇热膨胀过度，你可以在电泳槽里面安放冰槽，电泳液预先降温，同时降低电泳时的电流。还有配琼脂也要用缓冲液，而不是水，不然不导电。 接触不好也会引起条带变形
聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质纯度的鉴定，聚丙烯酰胺凝胶电泳同时具有电荷效应和分子筛效应，可以将分子大小相同而带不同数量电荷的物质分离开，并且还可以将带相同数量电荷而分子大小不同的物质分离开。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白质分子量，其原理是带大量电荷的SDS结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷质比。聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于蛋白质定量，电泳后的凝胶经凝胶扫描仪扫描，从而给出定量的结果，凝胶扫描仪主要用于对样品单向电泳后的区带和双向电泳后的斑点进行扫描。
