毛细管区带电泳法 【所用设备】主要部件有0~30kV可调稳压稳流电源，内径小于100μm(常用50~75μm)、长度一般为30~100cm的弹性石英毛细管、电极槽、检测器和进样装置。检测器有紫外/可见分光检测器、激光诱导荧光检测
优点：
1分析速度快、分离效率高、速度快和灵敏度高，柱效可高达每米数十万塔板、适用于带电样品的分离等。
2毛细管电泳具有样品消耗少、实验试剂成本低等优点。
3操作简单、适用面广、是最常用的HPCE模式。
4毛细管电泳又称高效毛细管电泳，是指以毛细管为分离室，以高压电场为驱动力的一类新型现代电泳技术。毛细管电泳引入高的电场强度，改善了分离质量，具有分离效率高、速度快和灵敏度高等特点，而且所需样品少、成本低，更为重要的是它又是一种自动化的仪器分析方法。
5毛细管电泳法与高效液相色谱一样同是液相分离技术，在很大程度上两者互为补充，但无论从效率、速度、用量和成本来说，毛细管电泳法都显示了它独特的优势。
毛细管区带电泳是芯片毛细管电泳分离蛋白质的一种最基本的分离模式。它基于不同的蛋白质分子在电场中的迁移速率不同而实现分离，是一种简单、快速的分离方法。采用区带电泳分离模式已成功地分离了多种蛋白质样品。
Colyer等采用毛细管电泳芯片，以区带电泳模式对人血清蛋白样品进行了分离，可分辨出4个蛋白质区带(即IgG、转铁蛋白、a-1-抗胰蛋白酶和白蛋白区带，分别用以模拟血清蛋白样品中的7、p、dl和白蛋白区带)。其中蛋白质的荧光标记在分离之后进行，由于荧光染料TNS(2-toluidinonaphtha．1-ene-5-sulfonate)标记血清蛋白的灵敏度较低，所以没能实现实际人血清蛋白样品的5个区带分离。Xiao等采用区带电泳模式，以50 mmoVL磷酸盐缓冲液(pH 2．15)作为工作缓冲液，在通道宽度为30um的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片中，于35s内实现了细胞色素C和溶菌酶的快速分离。Dodge等设计了集成8个微阀和1个微泵的PDMS芯片，通过微阀微泵实现了对液流的有效控制。他们首先采用区带电泳的分离模式分离牛血清白蛋白和肌红蛋白，然后通过阀的作用将分离后的蛋白质组分分别引入微混合器中酶解，最后对产物进行质谱分析。该工作显示芯片技术可用于质谱分析前复杂蛋白样品的预处理。庄等在石英芯片上以75 mmol/L硼酸盐缓冲液(pH 10．3)作为芯片电泳缓冲体系，分离了免疫球蛋白、O/一1一抗胰蛋白酶、牛血清白蛋白和铁传递蛋白，并对经临床确诊的妊娠高血压症、风湿性心脏病、多发性骨髓瘤患者的尿液样品进行电泳分析，在2 min内得到了与美国Helena电泳系统一致的分析结果。
在芯片毛细管电泳分离蛋白质的研究中所要解决的一个重要问题就是通道表面对大分子蛋白质的吸附问题。蛋白质与芯片通道内壁之问的微小吸附效应就会降低蛋白质的分离效率，引起峰形变宽拖尾，影响分离的重现性。在毛细管区带电泳分离模式下，一般采用通道内壁永久改性和缓冲液中加入添加剂进行动态修饰两种方法来抑制蛋白质的吸附。
Wu等采用多层88%水解聚丙烯醇(PVA)修饰PDMS芯片，以区带电泳模式有效分离了两种碱性蛋白质(溶菌酶和核糖核酸酶)以及两种典型的酸性蛋白质(牛血清白蛋白和口．乳球蛋白)。该涂层在pH 3～11范围内均可抑制电渗流的产生和蛋白的吸附作用，并且效果稳定，连续运行70次后分离效果仍然很好。该研究组随后又采用自组装方法在PDMS芯片通道表面加工环氧修饰的聚合物涂层抑制蛋白质的吸附，成功地分离了溶菌酶和核糖核酸酶A。Chiem等在运行缓冲液中加入了无机电解质NaCl和中性表面活性剂吐温20来抑制蛋白质的吸附，利用芯片毛细管区带电泳进行了单克隆抗体的分离分析。 ‘ 在蛋白质组学和蛋白质分离研究中，凝胶电泳是广泛使用的分离技术。它是以凝胶等聚合物作为分离介质，利用其网络结构并依据被测组分的分子体积不同而进行分离的一种分离模式。在芯片上采用凝胶电泳模式分离蛋白质，更有利于实现分离操作的高速度和高效率。Yao等采用十二烷基磺酸钠(SDS)凝胶电泳分离模式，对比了芯片SDS毛细管凝胶电泳与常规毛细管凝胶电泳系统分离蛋白质的性能，结果表明前者的分离效率明显优于后者，分离时间也明显低于后者。
与常规毛细管凝胶电泳相同，芯片毛细管凝胶电泳常用的筛分介质也分为凝胶和非胶聚合物溶液两种。交联聚丙烯酰胺凝胶是广泛使用的一种凝胶筛分介质，Herr等首次将传统的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS·PAGE)分离蛋白质的方法移植到芯片上，采用光聚合的方法在芯片通道内制备浓度为6%的交联聚丙烯酰胺凝胶作为筛分介质，在30S的时间内对相对分子质量(M，)在5 500～39 000之问的5种蛋白质进行分离，分离距离仅为4 mm，分离效率达到理论塔板数4．41×105。该研究组’1引后期又在微通道内制备了浓度为22%的交联聚丙烯酰胺膜用于蛋白质样品的预富集，有效富集了相对分子质量为12 000～205 000的蛋白质分子，并采用浓度为8%的交联聚丙烯酰胺凝胶作为筛分介质进行分离。
Agirregabiria等在聚甲基丙烯酸甲酯(PM—MA)芯片上使用SU一8光胶制作微通道，采用浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶作为筛分介质分离蛋白质。随后该研究组又在该芯片上集成金属电极，采用相同的分离模式成功地分离了相对分子质量分别为20 000和97 000的胰蛋白酶抑制剂和磷酸化酶两种蛋白质。然而，交联聚阿烯酰胺凝胶存在制备复杂、不易使用等问题。与其相比，线性聚丙烯酰胺(PLA)、聚乙烯醇(PEG)、聚氧化乙烯(PEO)等非胶筛分介质具有制备简单、使用方便、可以先聚合后注入通道而无需在通道内进行聚合反应等优点，适合在复杂的通道体系中使用，因此在芯片毛细管凝胶电泳中非胶筛分介质得到了广泛的应用。Yao等采用SDS 14·200凝胶缓冲液(Beckman Coulter公司产品)在玻璃芯片上于35 s内分离了相对分子质量在9 000～l 16 000之间的6种蛋白质。Giordano等将NanoOrange染料加入样品和缓冲液中进行蛋白质的动态标记，并对分离缓冲液体系进行了优化，最终选择5%的PEO(M，=100 000)作为筛分介质。该系统对牛血清白蛋白的检出限为500ng/mL，并完成了对实际人血清样品的分离分析。
在芯片毛细管凝胶电泳中，通道内壁对蛋白质的吸附仍是需要解决的重要问题。Bousse等使用聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)物理涂覆玻璃芯片微通道内壁，将电渗流降低到0．5×10～m zV s ．以SDS凝胶电泳的分离模式在40 s内分离了Bio—Rad公司的蛋白质标准样品’，分离效率达到107塔板/m。Nagata等在PMMA芯片中使用了PEG涂层，以5%线性聚丙烯酰胺为筛分介质，在分离长度为3 mm的通道内实现了胰蛋白酶抑制剂、牛血清白蛋白和卢半乳糖苷酶3种蛋白质的高速分离，分离时间仅为8 S 。 芯片等电聚焦分离蛋白质的原理与常规毛细管等电聚焦基本相同，都是依据蛋白质的等电点(pI)不同而进行分离。Hofmann等首次将毛细管等应用于蛋白质分析。
Li等在PDMS芯片和聚碳酸酯(PC)芯片上，采用等电聚焦模式分离厂牛血清白蛋白和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。Das等。26 3采用高聚物芯片，在等电聚焦电泳模式下优化了，分离长度及电压条件，最终在长1．9 cm的通道内于1．5 min内分离了绿荧光蛋白和R藻红蛋白，分离电压为500 V。Cui等在PDMS芯片上采用等电聚焦分离模式成功分离了组绿荧光蛋白、异藻青蛋白和藻红蛋白。该作者还报道，通过改变样品和分离介质中添加剂甲基纤维素的浓度，可以改变完成蛋白质分离所需要的通道距离，Tsai等通过采用六甲基二硅氧烷等离子聚合膜修饰玻璃芯片通道的方法抑制蛋白质吸附，在等电聚焦的分离模式下分离了藻青蛋白(pI：4·65)、血红蛋白(pI: 7．0)和细胞色素C(pI：9·6)3种蛋白质混合物，分离在3 min内完成，分离效率为19 600塔板/m。Huang等在进行芯片等电聚焦分离蛋白质时，采用在两性电解质溶液中加入羟甲基纤维素作为添加剂的方法来抑制蛋白质的吸附。 芯片毛细管电泳应用的成功促进了高速高效的芯片二维电泳技术的发展。对于多组分的复杂蛋白质样品，采用传统的一维分离方法通常无法满足要求，需要采用二维分离技术来提高分离效率，增加峰容量。与传统的毛细管电泳系统相比，在芯片上进行二维电泳分离，可以通过设计芯片通道结构实现通道的直接交叉或连通，而无需制作复杂的二维毛细管电泳接口，从而避免了因在接口处存在死体积而导致的谱带扩展现象。
在芯片二维电泳分离蛋白质的研究中，第一维分离模式多采用等电聚焦模式。Chen等制作了二维毛细管电泳PDMS芯片，利用第一维的等电聚焦和第二维的凝胶电泳对荧光标记的牛血清白蛋白和碳酸酐酶以及德科萨斯红标记的卵清蛋白进行分离分析。Li等设计了等电聚焦和凝胶电泳联用的二维分离高聚物心4t-片。蛋白质样品在完成第一维的等电聚焦分离后，可在多个并行的通道内完成第二维的凝胶电泳分离。整个分离过程在10 min内完成，峰容量达到1 700。Herr等：”1研制r采用十字通道构型的等电聚焦一自由区带电泳二维芯片系统，芯片通道宽200斗m，深20斗m，待测样品在横向通道中进行等电聚焦分离，分离后的样品区带在电场驱动下进入纵向区带电泳通道中进行第二维分离。系统采用荧光显微镜成像的方法对分离性能进行了评价，5 min内分离的峰容量达到1 300。Wang等通过在PDMS芯片中制作微阀来防止一维等电聚焦和二维凝胶电泳系统之间的分离缓冲液相混合，在20 rain内有效分离了4种标准蛋白质。也有报道在PMMA芯片上进行SDS凝胶电泳和胶束电动毛细管电泳相结合的蛋白质二维电泳分离。该系统在12 min内完成10种蛋白质的分离，峰容量约为l 000。
此外，还有一类基于芯片的二维分离系统主要应用于蛋白质酶解物的分离分析。通常第一维分离采用胶束电动毛细管电泳或毛细管电色谱模式，第二维分离采用区带电泳模式2000年，Ramsey课题组。“1首次在玻璃芯片上建立了胶束电动毛细管电泳(第一维)与区带电泳(第二维)结合的二维分离系统，并应用于细胞色素C、核糖核酸酶、d哥L白蛋白等的胰蛋白酶降解产物分离。其后，该课题组对系统进行了改进，加长了第一维电泳通道的长度，并采用细径转角通道来降低扩散，在约15 min内分离了牛血清白蛋白酶解物，峰容量达到4 200。2001年，他们还研制了开管电色谱和区带电泳相结合的芯片二维电泳系统，其电色谱分离部分采用长25 cm的具有十八烷基三甲氧基硅烷涂层的环状通道，区带电泳部分则采用长1．2 am的直形通道，在13 min内实现了届一酪蛋白胰蛋白酶解产物的分离。
相对于一维分离芯片，二维芯片分离系统具有很高的分离效率和峰容量，预计会在复杂蛋白质样品的分离上发挥更大的作用。 微流控芯片毛细管电泳系统应用于蛋白质的分离分析具有突出的优越性，特别是在临床检验及现场监测等方面的应用具有良好的发展前景，同时，其对分析仪器的集成化、微型化与便携化的发展也具有重要意义。据文献报道，Renzi等已经研制出手持式的微流控芯片电泳分离蛋白质装置。该装置由电泳芯片、小型激光诱导荧光检测系统以及高压电源等组成，其体积仅为11．5 cm×11．5 cm×19．0 cm，可用于现场分析、床旁医学诊断以及取证分析。近年来，国内已有关于利用芯片毛细管电泳进行临床尿蛋白和脂蛋白检测的报道。最近，Pandey等”川使用Caliper公司和Agilent公司的P200蛋白质芯片来检测微量的白蛋白尿，将蛋白质的电泳分离和荧光检测集成化、自动化，实现了其在临床实验室的应用。
目前，很多科研工作者正致力于微流控芯片毛细管电泳与质谱联用技术的研究，以进一步提高系统对复杂样品的分离分析能力。上述系统在蛋白质分离分析及蛋白质组研究中有广阔的应用前景。尤其是对于复杂蛋白质样品的多维分离分析，芯片毛细管电泳以其快速高效的特点，可以作为其中的一维分离方法，显著提高蛋白质的分析通量。相信随着研究的不断深入及相关技术的不断发展，微流控芯片毛细管电泳蛋白质分离技术将日趋成熟，在生化分析、临床诊断和蛋白质组研究领域发挥重要的作用
一、基本原理
在分离毛细管的两端加上高电压后，强电场引起毛细管内壁的H+电荷产生定向移动（即电渗流），其速度大于电泳速度。因而不管溶质是阴离子还是阳离子，都向阳极移动。阳离子流速比电渗流快，阴离子流速比电渗流慢，中性分子与电流一致。由于各离子迁移率不同，从而达到分离目的。
鉴于有机酸的紫外吸收较弱，需采用间接紫外法进行检测，即在背景电解质中加入强紫外吸收物质以增强紫外检测背景，当弱吸收物质通过检测器时，因冲淡了检测背景而出现倒紫外吸收峰，从而提高弱紫外吸收物质的检测灵敏度。由于有机酸阴离子移动方向与电渗流移动方向相反，故流速慢于电渗流，造成出峰时间很长。如果在背景电解质中加入电渗流改性剂（如十六烷基三甲基溴化铵），使电渗流方向反转，则阴离子出峰时间很快。另外，采用检测波长与参比波长对调的方法，使有机酸负峰转为正峰。在检测波长处吸收值达到最大，在参比波长处没有紫外吸收或吸收较弱，两者相减，扣除本底噪音。
二、实验
1实验仪器与试剂
实验所用仪器有HP3DCE高效毛细管电泳仪（美国惠普公司产）、50cm×50μm内径熔融石英毛细管（有效长度485cm）和二极管阵列检测器；所用试剂为3,5-二硝基苯甲酸（化学纯）和其他试剂（分析纯）。背景电解质溶液及有机酸标准和样品均用二次蒸馏水配制。
2实验条件
（1）电解质体系A 该体系为10×10-3mol/L二硝基苯甲酸和05×10-3mol/L十六烷基三甲基溴化铵混合液，5%甲醇，pH=9。检测器检测波长254nm，参比波长380nm。将检测波长与参比波长对调，使负峰转为正峰。采用负电源，分离电压30kV，进样压力5000Pa,10s，温度25℃，每次电泳前毛细管用01mol/L NaOH及缓冲溶液各冲洗5min。
（2）电解质体系B 该体系为5×10-3mol/L邻苯二甲酸氢钾与05×10-3mol/L十六烷基三甲基溴化铵溶合液，pH=6，检测波长为210nm，参比波长为300nm，进样压力为5000Pa,2s，其他同体系A。
3样品预处理
样品采自DG油田。将缓冲溶液、有机酸标准及水样分别用045μm微孔水系样品滤膜过滤，直接进行分析（样品有机酸浓度高时，需稀释）。
三、实验结果与讨论
1有机酸标准分离谱图
体系A、B中有机酸（酸的浓度分别均为5mg/L和100mg/L）的分离谱图见图11-9。由图中可以看出，各有机酸分离效率很高。以乙酸峰计算，其理论塔板数均达十几万。
图11-9 两种体系中一元羧酸分离谱图
2背景电解质组成对有机酸分离的影响
对体系B，按程中第等选定的条件进行实验。
对体系A，则进行了电解质溶液组成对分离的影响实验。
1）电解质溶液pH值对有机酸有效迁移率的影响
实验结果表明，电解质溶液pH值直接影响有机酸的有效迁移率。在pH小于6时，各有机酸有效淌度随pH值变化而变化；在pH大于6时，各有机酸均成为有机酸阴离子，淌度变化不大。本实验中我们选择pH=9。
2）电解质溶液浓度对有机酸分离效率的影响
实验表明，二硝基苯甲酸浓度增加时，各有机酸迁移速度增加，有利于保留时间短的组分的分离；但随着浓度的继续增加，毛细管中电流及热效应增大，使电解质溶液粘度发生变化，从而造成组分峰形展宽，分离效率下降，同时基线噪音也相应增大。因此，本实验选择二硝基苯甲酸的浓度为10×10-3mol/L。
实验还揭示表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵可以改变电渗流的迁移方向，使之与有机酸阴离子的电泳方向一致，从而缩短有机酸阴离子的分析时间，减少分析离子在毛细管中的扩散，而其浓度对分析离子的分离度没有明显的影响。但随着浓度的增大，基线噪音增大。因此，实验中选择其浓度为05×10-3mol/L。同时，实验还表明，加入一定量甲醇有助于避免峰形发生畸变，但随甲醇含量增加，基线噪声也随之增加。综合考虑上述因素，本文选择甲醇质量分数为5%。
3油田水样的分离
在体系A、B选定的条件下，将油田水样稀释25倍，以5000Pa压力进样10s，分离谱图见图11-10。体系A对各有机酸的检测灵敏度较高，但甲酸检测不到；体系B则从C1—C5一元羧酸中均可测定。
图11-10 两种体系下油田水中一元羧酸分离谱图
各有机酸以标准共注法定性，以色谱内加法定量。定性结果（图11-10）表明，油田水中的有机酸以甲酸、乙酸、丙酸和丁酸为主，还含有少量其他有机酸。由于油田水有机酸的无机组分含量很高，只有经数倍至数十倍稀释才能使之分离，因而有些含量低的组分未能检出。
将上述水样进样7次，测得各酸相对标准偏差在11%～35%之间。
4讨论
（1）高效毛细管区带电泳法对于含有大量无机组分的油田水中有机酸的分离简便、快速，数分钟之内即可获得高效分离，其理论塔板数可达十几万至几十万。
（2）二硝基苯甲酸-十六烷基三甲基溴化铵体系对油田水有机酸的最佳分离条件为：二硝基苯甲酸浓度为10×10-3mol/L，十六烷基三甲基溴化铵浓度为05×10-3mol/L,5%（质量分数）甲醇，pH=9。
